基本信息
基因工程的基本操作程序
教学内容
课前准备：通过预习解决以下问题
1、基因工程的基本操作程序主要包括哪几个步骤？
2、试分析每一步骤的必要性。
师：通过预习同学们都能解决第一个问题，基因工程的基本操作程序包括……
生：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。
师：第二个问题我们可以将它拆分成四个小问题逐个儿解决：
1、为什么要有“目的基因的获取”这一步？
先请一个同学将基因工程的原理告诉大家。
生：基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
师：这既是基因工程的原理又是其概念，通过这一表述中的“创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品”你得出什么样的信息？
生：这是基因工程的优点也是基因工程的目的，可以实现这一目标的只有目的基因，有了目的基因我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。
师：很好，良好的开端等于成功的一半，我们继续往下分析
2、为什么要有“表达载体的构建”这一步？
生：构建表达载体的目的是为了使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能表达和发挥作用。（教材P11）
师：看来同学们课前已经进行了精心预习了，那么第三步 “目的基因导入受体细胞”它又是出于什么目的呢？
生：单独的DNA片段──目的基因是不能稳定遗传的，含有目的基因的表达载体只有进入受体细胞，并且维持稳定和表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。（教材P12）
师：最后一步“目的基因的检测与鉴定”呢？
生：这是因为目的基因是否真正插入受体细胞的DNA中，是否能够在受体细胞中稳定遗传和正确表达，只有通过检测、鉴定才能得知。（教材P13）
师：看来基因工程的每个操作步骤都是必不可少的，下面我们按照基因工程的操作步骤，对每一程序的相关技术和方法进行学习
一、目的基因的获取
通俗地讲就是将需要的基因从供体生物的细胞内提取出来。阅读教材9～11页相关内容，回答下列问题：
1、什么是目的基因，举例说明。
生：目的基因主要是指编码蛋白质的结构基因，例如，与生物抗逆性有关的基因、与优良品质相关的基因、与生物药物和保健品有关的基因、与毒物降解有关的基因，以及与工业所需用酶相关的基因等。
师：同样目的基因还可以是一些具有调控作用的因子。目前被较广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、人胰岛素基因、人干扰素基因、种子贮藏蛋白基因、植物抗病基因等。
师：获得目的基因的方法有哪些？
生：可以从基因文库中获取目的基因，还可以利用PCR技术扩增目的基因。
师：什么是基因文库？
生：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。
师：什么是部分基因文库？
生：只含有一种生物的一部分基因，这样的基因文库叫做部分基因文库。
师：基因文库包含了某种生物的全部基因，又可称为基因组文库，如果将每个基因看成一本书则基因文库就可以比喻成国家图书馆，这里的资料既多又齐全，而部分基因文库只包含了该生物的部分基因，如，cDNA文库，因此部分基因文库只能比喻成某个市或单位的图书馆。阅读教材P11的生物技术资料卡，比较cDNA文库和基因组文库的区别。
师：怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？
生：根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA，以及基因翻译产物蛋白质等特性来获取目的基因。
师：很好。除了这种方法我们还可以利用PCR技术扩增目的基因。PCR是聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)的缩写，是一项再生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。通过此技术，可获取大量的目的基因。通过阅读教材完成下列填空。
原理： （DNA的复制）
条件： （已知基因的核苷酸序列，四种脱氧核苷酸，一对引物，DNA聚合酶）
方式：以 （指数）方式扩增，即 （2n）（n为扩增循环的次数）
结果： （使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增）
过程：a、DNA变性（90℃-96℃）：目的基因DNA受热变性， （氢键断裂），形成 （DNA单链）。b、退火（复性25℃-65℃）：系统温度降低， （引物）与 （DNA模板）结合，形成局部双链。c、延伸（70℃-75℃）：合成链在 （DNA聚合酶）作用下进行延伸，合成与模板互补的DNA。
师：此外，如果基因比较小，核苷酸序列又已知，也可以通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。
二、基因表达载体的构建
这是实施基因工程的第二步也是基因工程的核心。
1.用一定的_________（限制酶）切割质粒，使其出现一个切口，露出_________（黏性末端）。
2.用_____________（同一种限制酶）切断目的基因，使其产生__________（相同的黏性末端）。
3.将切下的目的基因片段插入质粒的______（切口）处，再加入适量_______（DNA连接酶），形成了一个重组DNA分子（重组质粒）
师：看图1-10基因的表达载体模式图总结基因表达载体的组成。
生：基因表达载体是由复制原点，目的基因，启动子，终止子，标记基因
师：它们各自的作用是什么呢？
生：启动子是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。
生：终止子位于基因的尾端，是一段特殊结构的DNA短片段，使转录在所需要的地方停止下来。
生：标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。
师：并不是所有的基因表达载体都是一样，根据受体细胞的不同它们也会有相应的变化。
三、将目的基因导入受体细胞
师：将目的基因导入受体细胞的方法，目前开发出来的已有很多种，每种方法都有其利弊，适合于不同的受体细胞，在具体实施过程中，究竟选哪种方法，要根据具体情况而定。
1、将目的基因导入植物细胞
常用的方法有农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法，阅读教材P12回答下列问题：
你能说说农杆菌转化法的大概过程吗？
根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理，你能分析出农杆菌不能将目的基因导入单子叶植物的原因吗？
生：根瘤农杆菌具有趋化性，即植物的受伤组织会产生一些糖类和酚类物质吸引根瘤农杆菌向受伤组织集中，而研究表明这种物质是在双子叶植物的细胞壁中合成的，通常不存在于单子叶植物中，这也是单子叶植物不被根瘤农杆菌侵染的原因。
如果想将一个抗病基因导入单子叶植物，理论上你认为该怎么做？
生：①选择合适的农杆菌菌株，②加趋化和诱导的物质使农杆菌向植物受伤组织靠拢。
2、将目的基因导入动物细胞
显微注射技术是转基因动物中采用最多，也是最为有效的一种将目的基因导入动物细胞的方法。
3、将目的基因导入微生物细胞
思考：为什么选用微生物作为受体细胞？
生：原核生物具有一些其他生物没有的特点：繁殖快，多为单细胞、遗传物质相对较少等，因此，早期的基因工程都用原核生物作为受体细胞。
师：大肠杆菌细胞最常用的转化方法是:
首先用Ca2+ 处理细胞,以增大细菌细胞壁的通透性,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,这种细胞称为感受态细胞.
第二步是将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合,在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子,完成转化过程.
第二步目的基因在受体细胞内，随其繁殖而复制，由于细菌繁殖的速度非常快，在很短的时间内就能获得大量的目的基因。
思考：为什么要用Ca2＋处理细胞？
生：因为大肠杆菌等细菌的细胞壁成分主要是肽聚糖，因此一般要先用Ca2＋处理，以增加细菌细胞壁的通透性。
四、目的基因的检测与鉴定
师：受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因完成了表达吗？
生：不能，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达。
师：这是基因工程的最后一步也是检查基因工程是否做成功的一步。它可以从以下三个是方面进行检测：
检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，一般采用的方法是DNA分子杂交。采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。
检测目的基因是否转录出mRNA方法是分子杂交。
检测目的基因是否翻译成蛋白质进行抗原—抗体杂交。
作业：
1. 教材15页“思考与探究”第4题
2. 教材11页“寻根问底”
